Perbedaan Kunci – Kloning Gen vs PCR
Sintesis banyak salinan DNA dari fragmen DNA tertentu disebut amplifikasi DNA. Ada dua proses amplifikasi DNA utama yaitu kloning gen dan PCR. Perbedaan utama antara kloning gen dan PCR adalah, kloning gen menghasilkan banyak salinan gen spesifik in vivo dengan membangun DNA rekombinan dan tumbuh di dalam bakteri inang sementara PCR menghasilkan jutaan salinan fragmen DNA spesifik secara in vitro menjalani siklus berulang denaturasi dan sintesis.
Apa itu Kloning Gen?
Kloning gen adalah teknik yang digunakan untuk menemukan dan menggandakan gen spesifik dari DNA genom yang diekstraksi dari suatu organisme melalui konstruksi DNA rekombinan. DNA genom mengandung ribuan gen berbeda yang dikodekan untuk protein. Ketika DNA diekstraksi, itu mencakup semua gen yang mungkin dapat ditanggungnya. Teknik kloning gen telah memungkinkan deteksi gen tertentu dari total DNA. Oleh karena itu kloning gen berfungsi sebagai alat penting dalam biologi molekuler.
Membuat perpustakaan genom suatu organisme sangat penting dalam kloning gen jika tidak ada petunjuk tentang lokasi gen yang relevan dalam DNA. Pustaka genom dibuat menggunakan langkah-langkah berikut.
Langkah 1: Ekstraksi total DNA dari organisme yang mengandung gen yang diinginkan.
Langkah 2: Pembatasan pencernaan DNA yang diekstraksi untuk menghasilkan fragmen kecil yang dapat dikelola. Langkah ini difasilitasi oleh endonuklease restriksi.
Langkah 3: Pemilihan vektor yang sesuai dan pembukaan DNA vektor menggunakan endonuklease restriksi yang sama. Plasmid bakteri biasanya digunakan sebagai vektor untuk membawa DNA asing. Plasmid adalah lingkaran kecil DNA yang terletak di dalam bakteri.
Langkah 4: Penggabungan DNA vektor dan DNA terfragmentasi untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan. Langkah ini diatur oleh DNA ligase.
Langkah 5: Mentransfer molekul DNA rekombinan ke bakteri inang. Langkah ini dikenal sebagai transformasi, dan dilakukan dengan menggunakan kejutan panas.
Langkah 5: Skrining sel bakteri yang ditransformasi pada media kultur. Sebuah populasi campuran sel inang yang ditransformasikan dan yang tidak ditransformasikan diperoleh pada akhir proses transformasi. Karena gen yang diinginkan hanya mencakup sel inang yang ditransformasi. Oleh karena itu, perlu untuk memilih sel yang diubah. Seleksi dilakukan dengan menggunakan media selektif yang mengandung antibiotik. Hanya sel-sel yang ditransformasi yang tumbuh pada media penyaringan ini yang memungkinkan seleksi.
Langkah 6: Menumbuhkan bakteri untuk menghasilkan perpustakaan gen. Pada langkah ini, sel inang yang telah diubah dimasukkan ke dalam media kultur segar yang menyediakan kebutuhan pertumbuhan yang optimal. Koloni total pada pelat kultur mewakili perpustakaan genom organisme tersebut.
Langkah 7: Molekul DNA rekombinan yang mengandung gen yang diinginkan harus disaring dari ribuan fragmen DNA rekombinan yang dikloning. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan probe yang menandai gen spesifik atau protein spesifik yang dihasilkan dari gen tersebut.
Setelah gen tertarik yang mengandung koloni bakteri diidentifikasi dari total koloni, dimungkinkan untuk membuat jutaan salinan plasmid rekombinan yang mengandung gen tersebut.
Kloning gen digunakan dalam membangun perpustakaan gen, memproduksi protein khusus, vitamin, antibiotik, hormon, pengurutan dan pemetaan genom organisme, membuat banyak salinan DNA individu dalam forensik, dll.
Gambar_1: Kloning Gen
Apa itu PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang menghasilkan banyak salinan dari fragmen DNA tertentu. Amplifikasi eksponensial dari sekuens DNA spesifik diperoleh dengan PCR dalam kondisi in vitro. Teknik ini adalah alat yang sangat ampuh dalam Biologi Molekuler karena dapat melipatgandakan sampel DNA yang kecil menjadi jumlah yang dapat digunakan. PCR diperkenalkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan penemuan pemenang hadiah ini menciptakan kemajuan besar dalam Biologi Molekuler.
Teknik
PCR mengikuti reaksi PCR berulang seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02. Satu reaksi PCR terdiri dari tiga langkah utama yang terjadi pada tiga suhu yang berbeda; denaturasi untai ganda pada DNA pada 94 0C, anil primer pada 68 0C dan pemanjangan untai pada 72 0 C. Oleh karena itu, ketika PCR dilakukan, fluktuasi suhu harus sangat dijaga untuk replikasi yang tepat. PCR dilakukan di mesin PCR di dalam tabung PCR. Tabung PCR diisi dengan campuran PCR yang benar yang mengandung DNA templat, Taq polimerase, primer, dNTP, dan buffer. Denaturasi DNA sampel untai ganda menjadi DNA untai tunggal dilakukan dengan memutus ikatan hidrogen antara basa komplementer pada 94 – 98 0C. Kemudian untai tunggal DNA templat diekspos untuk primer. Sepasang primer (maju dan mundur) harus disediakan, dan mereka harus termostabil untuk mentolerir suhu tinggi. Primer adalah sekuens DNA pendek beruntai tunggal yang melengkapi ujung fragmen DNA target. Primer sintetis digunakan dalam PCR. Primer mengikat dengan basa komplementer DNA sampel dan memulai sintesis untai baru. Langkah ini dikatalisis oleh enzim yang disebut Taq polimerase; enzim DNA polimerase termostabil diisolasi dari Thermus auqaticus. Ketika primer dan nukleotida (blok pembangun) tersedia, Taq polimerase membangun untai DNA baru yang melengkapi DNA cetakan. Pada akhir program PCR, fragmen DNA yang diamplifikasi diamati menggunakan elektroforesis gel. Jika analisis lebih lanjut diperlukan, produk PCR dimurnikan dari gel.
PCR sangat berguna untuk mendiagnosis dan memantau penyakit genetik dan didapat, identifikasi penjahat (di bidang forensik), mempelajari struktur dan fungsi segmen DNA yang ditargetkan, pengurutan dan pemetaan genom organisme, dll. PCR telah menjadi teknik laboratorium rutin di laboratorium penelitian medis dan biologi molekuler di kalangan ilmuwan karena memiliki berbagai aplikasi.
Gambar_2: Reaksi Rantai Polimerase
Apa perbedaan antara Kloning Gen dan PCR?
Kloning Gen vs PCR |
|
| Kloning gen adalah proses membuat banyak salinan gen tertentu secara in vivo melalui DNA rekombinan dan mengubahnya menjadi bakteri inang. | Teknik PCR menghasilkan banyak salinan dari sekuens DNA tertentu secara in vitro melalui siklus reaksi PCR yang berulang. |
| Persyaratan Pembuatan DNA Rekombinan | |
| DNA rekombinan diproduksi untuk menemukan gen. | DNA rekombinan tidak diproduksi. |
| Kebutuhan Tenaga Kerja | |
| Proses ini padat karya. | Pekerjaan intensif tidak diperlukan. |
| Proses In vivo atau In vitro | |
| Pembentukan DNA rekombinan dilakukan secara in vitro dan amplifikasi DNA dilakukan secara in vivo. | Amplifikasi DNA terjadi sepenuhnya secara in vitro. |
Ringkasan – Kloning Gen vs PCR
Kloning gen dan PCR adalah dua metode yang digunakan untuk amplifikasi DNA. PCR adalah proses in vitro yang membuat banyak salinan DNA dari fragmen DNA tertentu tanpa menggunakan DNA rekombinan dan organisme inang. Kloning gen terutama merupakan proses in vivo yang menghasilkan banyak salinan gen yang tertarik di dalam organisme inang melalui konstruksi DNA rekombinan. Inilah perbedaan antara Kloning gen dan PCR.
