Perbedaan utama antara Golden Gate dan Gibson Assembly adalah bahwa Golden Gate bergantung pada keberadaan situs pembatasan dalam urutan tertentu untuk dikloning, sedangkan Majelis Gibson tidak bergantung pada keberadaan situs pembatasan dalam urutan tertentu untuk dikloning.
Selama beberapa dekade terakhir, ilmuwan molekuler telah mengembangkan berbagai prosedur standar yang memungkinkan perakitan lebih mudah dari beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian. Oleh karena itu, metode kloning seperti Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly, dan TOPO Cloning banyak digunakan oleh para peneliti dalam eksperimen ilmiah. Oleh karena itu, Golden Gate dan Gibson Assembly adalah dua metode kloning molekuler yang memungkinkan perakitan beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian.
Apa itu Majelis Golden Gate?
Golden Gate adalah metode kloning molekuler yang memfasilitasi perakitan beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian. Metode ini bergantung pada keberadaan situs restriksi dalam urutan tertentu yang akan dikloning. Ini berasal dari tahun 1996. Teknik ini menggunakan enzim restriksi Tipe IIS dan DNA ligase T4. Enzim ini memotong DNA di luar situs pengenalan. Mereka dapat membuat overhang non-palindromik. Oleh karena itu, beberapa fragmen DNA dapat dirangkai menggunakan kombinasi urutan yang menggantung.
Gambar 01: Gerbang Emas
Prosedur Perakitan Gerbang Emas
Teknik Gerbang Emas memiliki tiga langkah utama dalam prosedurnya:
- pembuatan overhang dalam vektor kloning,
- perakitan beberapa sisipan DNA dengan menggunakan sekuens spesifik fragmen dalam overhang, dan
- ligasi.
Perakitan Gerbang Emas menggunakan vektor kloning melingkar (vektor tujuan). Selanjutnya, dalam metode ini, situs restriksi dihilangkan dari produk yang diligasi untuk melakukan digesti dan ligasi secara bersamaan. Protokol siklus termal tipikal untuk Golden Gate berosilasi antara 37 °C dan 16 °C karena 37 °C optimal untuk enzim restriksi dan 16 °C optimal untuk ligase.
Apa itu Majelis Gibson?
Gibson Assembly adalah metode kloning molekuler yang memungkinkan perakitan beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian. Berbeda dengan metode Golden Gate, metode ini tidak bergantung pada keberadaan situs restriksi dalam urutan tertentu yang akan dikloning. Itu ditemukan oleh Daniel G. Gibson dari J. Craig Venter Institute. Teknik ini merupakan salah satu jenis metode sequence dan ligase independent cloning (SLIC).
Gambar 02: Majelis Gibson
Prosedur Perakitan Gibson
Gibson Assembly membutuhkan fragmen DNA yang mengandung 20-40 pasangan basa yang tumpang tindih dengan fragmen DNA yang berdekatan. Tumpang tindih ditambahkan melalui PCR. Kemudian fragmen DNA ini ditambahkan ke dalam campuran maser Gibson yang memiliki tiga enzim. Prosedur ini dilakukan dalam kondisi isotermal (50 °C selama 1 jam) menggunakan tiga enzim yang berbeda: eksonuklease, DNA polimerase dan DNA ligase. Exonuclease mengunyah kembali DNA dari ujung 5 '. Dengan demikian, tidak menghambat aktivitas polimerase dan memungkinkan reaksi berlangsung dalam satu proses tunggal. Daerah untai tunggal yang dihasilkan pada fragmen DNA yang berdekatan dapat dianil karena urutan yang tumpang tindih. DNA polimerase mengisi celah dengan menambahkan nukleotida. Akhirnya, DNA ligase secara kovalen bergabung dengan DNA segmen yang berdekatan. Biasanya, Majelis Gibson menggunakan vektor tujuan linier. Selain itu, metode ini secara bersamaan dapat menggabungkan hingga 15 fragmen DNA berdasarkan kesamaan urutan.
Persamaan Antara Golden Gate dan Majelis Gibson
- Golden Gate dan Gibson Assembly adalah dua metode kloning molekuler.
- Kedua metode dapat merakit beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian.
- Metode ini menggunakan vektor tujuan.
- Kedua metode menggunakan siklus termal untuk perakitan beberapa fragmen DNA.
- Mereka digunakan dalam mutagenesis yang diarahkan ke situs.
Perbedaan Antara Golden Gate dan Majelis Gibson
Golden Gate adalah metode kloning molekuler yang digunakan dalam perakitan beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian dengan mengandalkan keberadaan situs restriksi dalam urutan tertentu yang akan dikloning, sedangkan Gibson Assembly adalah metode kloning molekuler yang digunakan dalam perakitan beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian tanpa bergantung pada keberadaan situs restriksi dalam urutan tertentu untuk dikloning. Inilah perbedaan utama antara Golden Gate dan Gibson Assembly. Selanjutnya, metode Golden Gate menggunakan vektor tujuan melingkar, sedangkan metode Majelis Gibson menggunakan vektor tujuan linier.
Infografik berikut menjelaskan perbedaan antara Golden Gate dan Gibson Assembly.
Ringkasan – Golden Gate vs Majelis Gibson
Kloning molekuler adalah metode yang digunakan untuk merakit molekul DNA rekombinan dan mengarahkan replikasinya di dalam organisme inang. Golden Gate dan Gibson Assembly adalah dua metode kloning molekuler yang memungkinkan perakitan beberapa fragmen DNA menjadi satu bagian. Metode Golden Gate bergantung pada keberadaan situs restriksi dalam urutan tertentu yang akan dikloning, sedangkan Gibson Assembly tidak bergantung pada keberadaan situs restriksi dalam urutan tertentu yang akan dikloning. Jadi, inilah perbedaan utama antara Golden Gate dan Gibson Assembly.
