Perbedaan Kunci – Blotting Utara vs Selatan vs Barat
Deteksi urutan spesifik DNA, RNA, dan protein sangat penting untuk berbagai jenis studi dalam biologi molekuler. Elektroforesis gel merupakan teknik pemisahan DNA, RNA, dan protein berdasarkan ukurannya. Dari profil gel, urutan DNA tertentu, urutan RNA, atau protein dideteksi dengan teknik khusus yang disebut blotting dan hibridisasi dengan probe berlabel. Ada tiga jenis metode blotting yang berbeda yaitu selatan, utara dan barat. Perbedaan utama antara blotting utara selatan dan barat terletak pada jenis molekul yang dideteksi dari sampel. Southern blotting adalah metode yang mendeteksi urutan DNA tertentu dari sampel DNA. Northern blotting adalah teknik yang mendeteksi urutan RNA tertentu dari sampel RNA. Western blotting adalah metode yang mendeteksi protein tertentu dari sampel protein.
Apa itu Southern Blotting?
Teknik Southern blotting dikembangkan oleh E. M. Southern pada tahun 1975 untuk identifikasi urutan DNA spesifik dari sampel DNA. Ini adalah teknik blotting pertama yang diperkenalkan dalam biologi molekuler. Ini memungkinkan deteksi gen spesifik dari DNA, fragmen spesifik dari DNA, dll. Ada beberapa langkah yang terlibat dalam teknik blotting selatan. Mereka adalah sebagai berikut.
- DNA diisolasi dari sampel dan dicerna dengan restriksi endonuklease.
- Sampel yang tercerna dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa.
- Fragmen DNA dalam gel didenaturasi menjadi untaian tunggal dengan menggunakan larutan basa.
- DNA beruntai tunggal ditransfer ke membran filter nitroselulosa melalui transfer kapiler.
- DNA yang ditransfer melekat pada membran secara permanen.
- DNA tetap pada membran dihibridisasi dengan probe berlabel.
- DNA yang tidak terikat dicuci dari membran dengan cara dicuci.
- Film sinar-X diekspos ke membran dan autoradiograf disiapkan.
Southern blotting diterapkan untuk berbagai aspek biologi molekuler. Ini berguna dalam pemetaan RFLP, studi forensik, metilasi DNA dalam ekspresi gen, deteksi gen yang bermutasi pada kelainan genetik, sidik jari DNA, dll.
Gambar 01: Teknik Southern Blotting
Apa itu Northern Blotting?
Northern blotting adalah metode yang dirancang untuk mendeteksi urutan RNA atau urutan mRNA tertentu dari sampel untuk mempelajari ekspresi gen. Teknik ini dikembangkan oleh Alwine, Kemp, dan Stark pada tahun 1979. Teknik ini berbeda dengan teknik sourthern dan western blotting karena beberapa langkah. Namun, teknik ini juga dilakukan melalui elektroforesis gel, blotting, dan hibridisasi dengan probe dan deteksi berlabel spesifik. Teknik Northern blotting dilakukan sebagai berikut.
- RNA diekstraksi dari sampel dan dipisahkan dengan elektroforesis gel.
- RNA ditransfer dari gel ke membran blotting dan difiksasi.
- Membran diperlakukan dengan probe berlabel yang dibuat dari cDNA atau RNA (probe melengkapi urutan tertentu dalam sampel).
- Probe diinkubasi dengan membran untuk mengikat dengan urutan tertentu.
- Probe yang tidak terikat dicuci.
- Fragmen hasil hibridisasi dideteksi oleh autoradiograf.
Northern blotting adalah alat penting dalam deteksi dan kuantifikasi mRNA hibridisasi, mempelajari degradasi RNA, evaluasi waktu paruh RNA, deteksi penyambungan RNA, mempelajari ekspresi gen, dll.
Gambar 02: Northern Blotting
Apa itu Western Blotting?
Western blotting adalah metode untuk mendeteksi protein tertentu dari campuran protein dengan menggunakan antibodi berlabel. Oleh karena itu, western blot juga dikenal sebagai immunoblot. Teknik ini diperkenalkan oleh Towbin et al pada tahun 1979 dan sekarang secara rutin dilakukan di laboratorium untuk analisis protein. Langkah-langkahnya adalah sebagai berikut.
- Protein diekstraksi dari sampel
- Protein dipisahkan berdasarkan ukurannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida
- Molekul yang terpisah dipindahkan ke membran PVDF atau membran nitroselulosa dengan elektroporasi
- Membran diblokir untuk pengikatan nonspesifik dengan antibodi
- Protein yang ditransfer terikat dengan antibodi primer (antibodi berlabel enzim).
- Membran dicuci untuk menghilangkan antibodi primer yang tidak terikat secara spesifik
- Antibodi terikat dideteksi dengan menambahkan substrat dan mendeteksi endapan berwarna yang terbentuk
Western blotting berguna dalam mendeteksi antibodi anti-HIV dalam sampel serum manusia. Western blot juga dapat digunakan sebagai uji konfirmasi infeksi Hepatitis B dan uji definitif penyakit sapi gila.
Gambar 03: Western Blotting
Apa perbedaan antara Northern Southern dan Western Blotting?
Utara vs Selatan vs Western Blotting |
|
| Jenis Molekul yang Terdeteksi | |
| Blotting Utara | Northern blotting mendeteksi urutan RNA tertentu dari sampel RNA. |
| Blotting Selatan | Southern blotting mendeteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA. |
| Western Blotting | Western blotting mendeteksi protein tertentu dari sampel protein. |
| Jenis Gel | |
| Blotting Utara | Ini menggunakan gel Agarose/formaldehyde. |
| Blotting Selatan | Ini menggunakan gel Agarose. |
| Western Blotting | Ini menggunakan gel Polyacrylamide. |
| Metode Blotting | |
| Blotting Utara | Ini adalah transfer kapiler. |
| Blotting Selatan | Ini adalah transfer kapiler. |
| Western Blotting | Ini adalah transfer listrik. |
| Probe Digunakan | |
| Blotting Utara | cDNA atau RNA probe berlabel radioaktif atau nonradioaktif. |
| Blotting Selatan | Probe DNA diberi label radioaktif atau non-radioaktif. |
| Western Blotting | Antibodi primer digunakan sebagai probe. |
| Sistem Deteksi | |
| Blotting Utara | Hal ini dilakukan dengan menggunakan autoradiograf, atau deteksi cahaya atau perubahan warna. |
| Blotting Selatan | Hal ini dilakukan dengan menggunakan autoradiograf, deteksi cahaya atau perubahan warna. |
| Western Blotting | Hal ini dilakukan dengan menggunakan deteksi cahaya atau perubahan warna. |
Ringkasan – Blotting Utara vs Selatan vs Barat
Blotting adalah teknik khusus yang dikembangkan untuk identifikasi DNA, RNA, atau protein spesifik dari sampel. Ada tiga prosedur blotting terpisah, yaitu utara, selatan dan barat, untuk mendeteksi jenis molekul tertentu. Teknik Northern blotting dirancang untuk mendeteksi urutan RNA tertentu dari campuran RNA. Teknik blotting selatan memungkinkan deteksi urutan DNA spesifik dari sampel DNA dan teknik western blotting dikembangkan untuk mengidentifikasi protein spesifik dari campuran protein.
