Perbedaan Kunci – Urutan Maxam Gilbert vs Sanger
Nukleotida adalah unit struktural dasar dan blok bangunan DNA. Molekul DNA tersusun atas rantai polinukleotida. Ada empat nukleotida berbeda yang ditemukan dalam DNA. Nukleotida ini terdiri dari empat basa nitrogen yang berbeda bernama A (adenin), G (guanin), C (sitosin), T (timin). Urutan nukleotida dalam molekul DNA sangat penting karena mengkodekan informasi genetik penting untuk pertumbuhan dan perkembangan organisme. Sekuensing DNA mengacu pada proses yang menentukan urutan nukleotida DNA yang tepat. Ada berbagai metode pengurutan DNA. Sekuensing Maxam Gilbert dan Sanger DNA sequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang termasuk dalam sekuensing generasi pertama. Prosedur sekuensing Maxam Gilbert menentukan urutan basa dengan membelah secara kimiawi fragmen DNA berlabel ujung 5’ secara istimewa pada masing-masing empat nukleotida dan elektroforesis gel. Prosedur sekuensing Sanger menentukan urutan nukleotida dengan mensintesis DNA beruntai tunggal menggunakan DNA polimerase dan dideoksinukleotida serta elektroforesis gel. Inilah perbedaan utama antara Maxam Gilbert dan Sanger Sequencing.
Apa itu Urutan Maxam Gilbert?
Sekuensing Maxam Gilbert, juga dikenal sebagai metode sekuensing kimia, adalah teknik yang dikembangkan untuk menentukan urutan nukleotida dalam DNA. Metode ini diperkenalkan oleh W alter Gilbert dan Alan Maxam pada tahun 1976 dan menjadi populer karena dapat dilakukan secara langsung dengan DNA yang dimurnikan. Metode Maxam Gilbert termasuk dalam generasi pertama pengurutan DNA, dan merupakan metode pengurutan pertama yang digunakan secara luas oleh para ilmuwan.
Prinsip dasar metode ini terletak pada pembatasan fragmen DNA berlabel akhir pada basa spesifik oleh bahan kimia dan kondisi spesifik basa dan pemisahan fragmen berlabel dengan elektroforesis seperti yang ditunjukkan pada gambar 01. Fragmen dipisahkan menurut dengan ukurannya pada gel. Karena fragmen diberi label, urutan molekul DNA dapat dengan mudah disimpulkan.
Metode Maxam gilbert menggunakan bahan kimia spesifik basa untuk memecah DNA pada basa tertentu. Dua bahan kimia umum bernama dimetil sulfat dan bahan kimia hidrazin digunakan masing-masing untuk menyerang purin dan pirimidin secara selektif.
Metode pengurutan Maxam Gilbert dilakukan melalui beberapa langkah sebagai berikut.
- Pemurnian sekuens DNA menggunakan endonuklease restriksi
- Pelabelan ujung fragmen DNA dengan menambahkan fosfat radioaktif
- Pemurnian fragmen berlabel dari fragmen tidak berlabel dengan elektroforesis gel
- Pemisahan DNA berlabel akhir menjadi empat tabung dan perlakuan dengan bahan kimia spesifik basa secara terpisah
- Elektroforesis isi masing-masing tabung pada garis terpisah pada gel dan pemisahan fragmen menurut panjangnya.
- Deteksi fragmen dengan autoradiograf.
Gambar 01: Urutan Maxam Gilbert
Apa itu Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing adalah metode sekuensing yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977 untuk menentukan urutan dasar dari fragmen DNA yang diberikan. Ini juga dikenal sebagai pengurutan terminasi rantai atau metode pengurutan Dideoxy. Metode ini bekerja berdasarkan prinsip penggabungan selektif dideoksinukleotida terminasi rantai (ddNTPs) seperti ddGTP, ddCTP, ddATP dan ddTTP oleh DNA polimerase selama sintesis DNA untai tunggal untuk menghentikan pembentukan untai. Dideoksinukleotida tidak memiliki gugus 3’ OH untuk pembentukan ikatan fosfodiester dengan nukleotida yang berdekatan. Oleh karena itu, pembentukan untai berhenti setelah ddNTP dimasukkan ke dalam untai yang baru terbentuk selama sekuensing sanger.
Dalam metode ini, empat reaksi sintesis DNA (PCR) terpisah dilakukan dalam empat tabung terpisah dengan satu jenis ddNTP. Persyaratan lain juga disediakan untuk tabung PCR termasuk primer, dNTP, Taq polimerase, kondisi spesifik, dll. Empat reaksi terpisah dilakukan dalam empat tabung dengan empat campuran. Setelah reaksi PCR, fragmen DNA yang dihasilkan didenaturasi dengan panas dan dipisahkan dengan elektroforesis gel. Kemudian fragmen divisualisasikan dengan menggunakan primer berlabel (radioaktif atau fluoresen) atau dNTP seperti yang ditunjukkan pada gambar 02.
Gambar 02: Urutan Sanger
Apa perbedaan antara Maxam Gilbert dan Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Pengurutan Maxam Gilbert adalah teknik pertama yang dikembangkan untuk pengurutan DNA. | Metode pengurutan Sanger diperkenalkan setelah metode pengurutan Maxam Gilbert. |
| Penggunaan | |
| Metode ini jarang digunakan. | Pengurutan Sanger secara rutin digunakan untuk pengurutan. |
| Penggunaan Bahan Kimia Berbahaya | |
| Menggunakan bahan kimia berbahaya. | Penggunaan bahan kimia berbahaya dibatasi dibandingkan dengan metode Maxam Gilbert. |
| Pelabelan untuk Deteksi | |
| Metode ini menggunakan radioaktif P32 untuk melabeli ujung-ujung fragmen DNA. | Pengurutan Sanger menggunakan ddNTP berlabel radioaktif atau fluoresen. |
Ringkasan – Urutan Maxam Gilbert vs Sanger
Maxam Gilbert dan Sanger sequencing adalah dua jenis teknik sekuensing DNA yang berada di bawah sekuensing DNA generasi pertama. Sekuensing Maxam Gilbert adalah metode pertama yang diperkenalkan untuk sekuensing DNA pada tahun 1976, dan ini dilakukan dengan memecah fragmen DNA berlabel akhir dengan bahan kimia spesifik dasar. Oleh karena itu, ini dikenal sebagai sekuensing kimia. Metode sekuensing Sanger diperkenalkan pada tahun 1977, dan didasarkan pada reaksi pemutusan rantai yang digerakkan oleh ddNTP. Metode Sanger sequencing lebih populer daripada metode Maxam Gilbert karena beberapa kelemahan metode Maxam Gilbert seperti konsumsi waktu yang berlebihan, penggunaan bahan kimia berbahaya, dll. Inilah perbedaan antara sekuensing Maxam Gilbert dan Sanger.
