Perbedaan Kunci – NGS vs Sanger Sequencing
Pengurutan Generasi Berikutnya (NGS) dan Pengurutan Sanger adalah dua jenis teknik pengurutan nukleotida yang dikembangkan dari waktu ke waktu. Metode Sanger Sequencing telah digunakan secara luas selama bertahun-tahun dan NGS menggantikannya baru-baru ini karena kelebihannya. Perbedaan utama antara NGS dan Sanger Sequencing adalah bahwa NGS bekerja berdasarkan prinsip pengurutan jutaan sekuens secara bersamaan dengan cara yang cepat melalui sistem pengurutan sementara Sanger Sequencing bekerja pada prinsip pemutusan rantai karena penggabungan selektif dideoksinukleotida oleh enzim DNA polimerase selama replikasi DNA dan pemisahan fragmen yang dihasilkan oleh elektroforesis kapiler.
Apa itu Urutan Nukleotida?
Informasi genetik disimpan dalam urutan nukleotida DNA atau RNA suatu organisme. Proses penentuan urutan nukleotida yang benar (menggunakan empat basa) dalam fragmen tertentu (dalam gen, gugus gen, kromosom, dan genom lengkap) dikenal sebagai sekuensing nukleotida. Hal ini sangat penting dalam studi genomik, studi forensik, virologi, sistematik biologis, diagnosis medis, bioteknologi dan di banyak bidang lain untuk menganalisis struktur dan fungsi gen. Ada berbagai jenis metode pengurutan yang dikembangkan oleh para ilmuwan. Diantaranya, Sanger sequencing yang dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1977 banyak digunakan dan dipopulerkan untuk jangka waktu yang lama sampai Next Generation Sequencing menggantikannya.
Apa itu NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) adalah istilah yang digunakan untuk merujuk pada proses pengurutan throughput tinggi modern. Ini menjelaskan sejumlah teknologi pengurutan modern yang berbeda yang merevolusi studi genomik dan Biologi Molekuler. Teknik tersebut adalah Illumina sequencing, Roche 454 sequencing, Ion Proton sequencing dan SOLID (Sequencing by Oligo Ligation Detection) sequencing. Sistem NGS lebih cepat dan lebih murah. Empat metode pengurutan DNA utama digunakan dalam sistem NGS yaitu; pyrosequencing, sekuensing dengan sintesis, sekuensing dengan ligasi dan sekuensing semikonduktor ion. Sejumlah besar untai DNA atau RNA (jutaan) dapat diurutkan secara paralel. Ini memungkinkan pengurutan seluruh genom organisme dalam waktu singkat, tidak seperti pengurutan Sanger yang membutuhkan waktu lebih lama.
NGS memiliki banyak keunggulan dibandingkan metode Sanger sequencing konvensional. Ini adalah proses berkecepatan tinggi, lebih akurat dan hemat biaya yang dapat dilakukan dengan ukuran sampel yang kecil. NGS dapat digunakan dalam studi metagenomik, dalam mendeteksi variasi dalam genom individu karena penyisipan dan penghapusan, dll., dan dalam analisis ekspresi gen.
Gambar_1: Perkembangan di NGS Sequencing
Apa itu Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing adalah metode sekuensing yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977 untuk menentukan urutan nukleotida yang tepat dari fragmen DNA yang diberikan. Ini juga dikenal sebagai sekuens pemutusan rantai atau sekuensing Dideoxy. Prinsip kerja metode ini adalah penghentian sintesis untai dengan penggabungan selektif dideoksinukleotida terminasi rantai (ddNTPs) seperti ddGTP, ddCTP, ddATP dan ddTTP oleh DNA polimerase selama replikasi DNA. Nukleotida normal memiliki 3' gugus OH untuk pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan untuk melanjutkan pembentukan untai. Namun, ddNTP tidak memiliki gugus 3 OH ini dan tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester antara nukleotida. Oleh karena itu, pemanjangan rantai dihentikan.
Dalam metode ini, DNA untai tunggal yang akan diurutkan berfungsi sebagai untai cetakan untuk sintesis DNA in vitro. Persyaratan lainnya adalah oligonukleotida primer, prekursor deoksinukleotida dan enzim DNA polimerase. Ketika ujung mengapit dari fragmen target diketahui, primer dapat dengan mudah dirancang untuk replikasi DNA. Empat reaksi sintesis DNA terpisah dilakukan dalam empat tabung terpisah. Setiap tabung memiliki ddNTP terpisah, bersama dengan persyaratan lainnya. Dari nukleotida tertentu, campuran dNTPs dan ddNTPs ditambahkan. Demikian juga, empat reaksi terpisah dilakukan dalam empat tabung dengan empat campuran. Setelah reaksi, deteksi fragmen DNA dan konversi pola fragmen menjadi informasi urutan dilakukan. Fragmen DNA yang dihasilkan mengalami denaturasi panas dan dipisahkan dengan elektroforesis gel. Jika nukleotida radioaktif digunakan, pola pita dalam gel poliakrilamida dapat divisualisasikan dengan autoradiografi. Ketika metode ini menggunakan dideoksinukleotida yang ditandai dengan fluoresensi, itu dapat dikurangi dengan membaca gel dan melewati sinar laser untuk dideteksi oleh detektor fluoresen. Untuk menghindari kesalahan yang mungkin timbul ketika suatu sequence dibaca oleh mata dan dimasukkan secara manual ke dalam komputer, metode ini dikembangkan menjadi penggunaan sequencer otomatis yang digabungkan dengan komputer.
Ini adalah metode yang digunakan untuk mengurutkan DNA dari proyek Genom Manusia. Metode ini masih digunakan dengan modifikasi lanjutan karena memberikan informasi urutan yang akurat meskipun prosesnya mahal dan lambat.
Gambar_2: Urutan Sanger
Apa perbedaan NGS dan Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) mengacu pada proses pengurutan throughput tinggi modern. Ini menjelaskan sejumlah teknologi pengurutan modern yang berbeda | Sanger Sequencing adalah metode sekuensing yang dikembangkan oleh Frederick Sanger untuk menentukan urutan nukleotida yang tepat dari fragmen DNA yang diberikan. |
| Efektifitas Biaya | |
| NGS adalah proses yang lebih murah karena mengurangi waktu, tenaga dan bahan kimia. | Ini adalah proses yang mahal karena membutuhkan waktu, tenaga, dan lebih banyak bahan kimia. |
| Kecepatan | |
| Ini lebih cepat karena deteksi kimia dan deteksi sinyal dari banyak untai terjadi secara paralel. | Ini memakan waktu karena deteksi kimia dan deteksi sinyal terjadi sebagai dua proses terpisah dan hanya pada untai yang dapat membaca pada satu waktu. |
| Keandalan | |
| NGS dapat diandalkan. | Pengurutan Sanger kurang dapat diandalkan |
| Ukuran Sampel | |
| NGS membutuhkan lebih sedikit DNA. | Metode ini membutuhkan DNA cetakan dalam jumlah besar. |
| Basis DNA per Fragmen Terurut | |
| Jumlah basa DNA per fragmen yang diurutkan lebih rendah dari metode Sanger | Sekuens pembangkit lebih panjang dari pada NGS. |
Ringkasan – NGS vs Sanger Sequencing
NGS dan Sanger Sequencing adalah teknik sekuensing nukleotida yang banyak digunakan dalam Biologi Molekuler. Pengurutan Sanger adalah metode pengurutan awal yang digantikan oleh NGS. Perbedaan utama antara NGS dan Sanger Sequencing adalah bahwa NGS adalah proses berkecepatan tinggi, lebih akurat dan hemat biaya daripada Sanger sequencing. Kedua teknik tersebut menciptakan wabah besar dalam Genetika dan Bioteknologi.
