Perbedaan Kunci – Microarray vs RNA Sequencing
Transcriptome mewakili seluruh isi RNA yang ada dalam sel termasuk mRNA, rRNA, tRNA, RNA yang terdegradasi, dan RNA yang tidak terdegradasi. Membuat profil transkriptom adalah proses penting untuk memahami wawasan sel. Ada beberapa metode lanjutan untuk pembuatan profil transkriptom. Sekuensing mikroarray dan RNA adalah dua jenis teknologi yang dikembangkan untuk menganalisis transkriptom. Perbedaan utama antara microarray dan sekuensing RNA adalah bahwa microarray didasarkan pada potensi hibridisasi probe berlabel yang telah dirancang sebelumnya dengan sekuens cDNA target sementara sekuensing RNA didasarkan pada pengurutan langsung untaian cDNA dengan teknik pengurutan lanjutan seperti NGS. Microarray dilakukan dengan pengetahuan sebelumnya tentang sekuens dan sekuensing RNA dilakukan tanpa pengetahuan sebelumnya tentang sekuens.
Apa itu Microarray?
Microarray adalah metode throughput yang kuat, andal, dan tinggi yang digunakan untuk pembuatan profil transkriptom oleh para ilmuwan. Ini adalah pendekatan yang paling populer untuk analisis transkrip. Ini adalah metode berbiaya rendah, yang bergantung pada probe hibridisasi.
Teknik dimulai dengan ekstraksi mRNA dari sampel dan pembangunan perpustakaan cDNA dari RNA total. Kemudian dicampur dengan probe pradesain berlabel fluoresensi pada permukaan padat (matriks titik). Urutan komplementer berhibridisasi dengan probe berlabel di microarray. Kemudian microarray dicuci dan disaring, dan gambar dikuantifikasi. Data yang dikumpulkan harus dianalisis untuk mendapatkan profil ekspresi relatif.
Intensitas probe microarray diasumsikan sebanding dengan jumlah transkrip dalam sampel. Namun, keakuratan teknik tergantung pada probe yang dirancang, pengetahuan sebelumnya tentang urutan dan afinitas probe untuk hibridisasi. Oleh karena itu teknologi microarray memiliki keterbatasan. Teknik microarray tidak dapat dilakukan dengan transkrip kelimpahan rendah. Gagal membedakan isoform dan mengidentifikasi varian genetik. Karena metode ini bergantung pada hibridisasi probe, beberapa masalah yang terkait dengan hibridisasi seperti hibridisasi silang, hibridisasi nonspesifik, dll. terjadi dalam teknik microarray.
Gambar 01: Microarray
Apa itu Sekuensing RNA?
RNA shotgun sequencing (RNA seq) adalah teknik sekuensing transkriptom yang dikembangkan baru-baru ini. Ini adalah metode pembuatan profil transkriptom yang cepat dan tinggi. Ini secara langsung mengukur ekspresi gen dan menghasilkan penyelidikan mendalam terhadap transkriptom. Seq RNA tidak bergantung pada probe yang telah dirancang sebelumnya atau pengetahuan sebelumnya tentang sekuens. Oleh karena itu, metode RNA seq memiliki sensitivitas dan kemampuan yang tinggi untuk mendeteksi gen baru dan varian genetik.
Metode pengurutan RNA dilakukan melalui beberapa langkah. Total RNA sel harus diisolasi dan difragmentasi. Kemudian, dengan menggunakan reverse transcriptase, perpustakaan cDNA harus disiapkan. Setiap untai cDNA harus diikat dengan adaptor. Kemudian fragmen yang diikat harus diamplifikasi dan dimurnikan. Terakhir menggunakan metode NGS, pengurutan cDNA harus dilakukan.
Gambar 02: Urutan RNA
Apa perbedaan antara sekuensing Microarray dan RNA?
Microarray vs RNA Sequencing |
|
| Microarray adalah metode throughput yang kuat, andal, dan tinggi. | RNA sequencing adalah metode yang akurat dan throughput tinggi. |
| Biaya | |
| Ini adalah metode berbiaya rendah. | Ini adalah metode yang mahal. |
| Analisis Sejumlah Besar Sampel | |
| Ini memfasilitasi analisis sejumlah besar sampel secara bersamaan. | Ini memudahkan menganalisis sejumlah besar sampel. |
| Analisis Data | |
| Analisis data rumit. | Lebih banyak data dihasilkan dalam metode ini; karenanya, prosesnya lebih kompleks. |
| Pengetahuan Sebelumnya tentang Urutan | |
| Metode ini didasarkan pada probe hibridisasi, jadi diperlukan pengetahuan sebelumnya tentang urutan. | Metode ini tidak bergantung pada pengetahuan urutan sebelumnya. |
| Variasi Struktural dan Gen Novel | |
| Metode ini tidak dapat mendeteksi variasi struktural dan gen baru. | Metode ini dapat mendeteksi variasi struktural seperti fusi gen, splicing alternatif, dan gen baru. |
| Sensitivitas | |
| Ini tidak dapat mendeteksi perbedaan ekspresi isoform, jadi sensitivitasnya terbatas. | Ini memiliki sensitivitas tinggi. |
| Hasil | |
| Ini hanya dapat menghasilkan level ekspresi relatif. Ini tidak memberikan kuantifikasi mutlak ekspresi gen. | Ini memberikan tingkat ekspresi absolut dan relatif. |
| Analisis Ulang Data | |
| Ini perlu dijalankan ulang untuk menganalisis ulang. | Data pengurutan dapat dianalisis ulang. |
| Kebutuhan Personil dan Prasarana Khusus | |
| Infrastruktur dan personel khusus tidak diperlukan untuk microarray. | Infrastruktur dan personel khusus yang dibutuhkan oleh pengurutan RNA. |
| Masalah Teknis | |
| Teknik microarray memiliki masalah teknis seperti hibridisasi silang, hibridisasi nonspesifik, tingkat deteksi terbatas dari probe individu, dll. | Teknik seq RNA menghindari masalah teknis seperti hibridisasi silang, hibridisasi nonspesifik, tingkat deteksi terbatas dari probe individu, dll. |
| Bias | |
| Ini adalah metode yang bias karena bergantung pada hibridisasi. | Bias rendah dibandingkan dengan microarray. |
Ringkasan – Microarray vs RNA Sequencing
Metode pengurutan mikroarray dan RNA adalah platform throughput tinggi yang dikembangkan untuk pembuatan profil transkriptom. Kedua metode menghasilkan hasil yang sangat berkorelasi dengan profil ekspresi gen. Namun, sekuensing RNA memiliki keunggulan dibandingkan microarray untuk analisis ekspresi gen. Sekuensing RNA adalah metode yang lebih sensitif untuk mendeteksi transkrip dengan kelimpahan rendah daripada microarray. Sekuensing RNA juga memungkinkan diferensiasi antara isoform dan identifikasi varian gen. Namun, microarray adalah pilihan umum sebagian besar peneliti karena pengurutan RNA adalah teknik baru dan mahal dengan tantangan penyimpanan data dan analisis data yang kompleks.
