Perbedaan Kunci – Pengurutan Sanger vs Pyrosequencing
Pengurutan DNA sangat penting untuk analisis DNA karena pengetahuan tentang susunan nukleotida yang benar pada wilayah DNA tertentu mengungkapkan banyak informasi penting tentangnya. Ada berbagai metode pengurutan DNA. Sequencing Sanger dan Pyrosequencing adalah dua metode sekuensing DNA yang berbeda yang banyak digunakan dalam Biologi Molekuler. Perbedaan utama antara sekuensing Sanger dan Pyrosequencing adalah bahwa sekuensing Sanger menggunakan dideoksinukleotida untuk menghentikan sintesis DNA untuk membaca urutan nukleotida sementara pyrosequencing mendeteksi pelepasan pirofosfat dengan memasukkan nukleotida dan mensintesis urutan pelengkap untuk membaca urutan urutan yang tepat.
Apa itu Sanger Sequencing?
Pengurutan Sanger adalah metode pengurutan DNA generasi pertama yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya pada tahun 1977. Metode ini juga dikenal sebagai Pengurutan Terminasi Rantai atau Pengurutan Dideoksi karena didasarkan pada pemutusan rantai oleh dideoksinukleotida (ddNTPs). Metode ini banyak digunakan selama lebih dari 30 tahun hingga New Generation Sequencing (NGS) dikembangkan. Teknik sekuensing Sanger memungkinkan penemuan urutan nukleotida yang benar atau perlekatan fragmen DNA tertentu. Ini didasarkan pada penggabungan selektif ddNTPs dan penghentian sintesis DNA selama replikasi DNA in vitro. Tidak adanya gugus 3 OH untuk melanjutkan pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida yang berdekatan adalah fitur unik dari ddNTPs. Oleh karena itu, setelah ddNTP terpasang, pemanjangan rantai berhenti dan berakhir dari titik itu. Ada empat ddNTP – ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP – yang digunakan dalam pengurutan Sanger. Nukleotida ini menghentikan proses replikasi DNA ketika mereka dimasukkan ke dalam untai DNA yang sedang tumbuh dan menghasilkan panjang DNA pendek yang bervariasi. Elektroforesis gel kapiler digunakan untuk mengatur untaian DNA pendek ini berdasarkan ukurannya pada gel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 01.
Gambar 1: Elektroforesis gel kapiler dari DNA pendek yang disintesis
Untuk replikasi DNA in vitro, beberapa persyaratan harus disediakan. Mereka adalah enzim DNA polimerase, DNA template, primer oligonukleotida, dan deoksinukleotida (dNTPs). Dalam sekuensing Sanger, replikasi DNA dilakukan dalam empat tabung reaksi terpisah bersama dengan empat jenis ddNTP secara terpisah. Deoksinukleotida tidak sepenuhnya digantikan oleh masing-masing ddNTP. Campuran dNTP tertentu (misalnya; dATP + ddATP) dimasukkan ke dalam tabung dan direplikasi. Empat produk tabung terpisah dijalankan pada gel di empat sumur terpisah. Kemudian dengan membaca gel, urutan dapat dibangun seperti yang ditunjukkan pada Gambar 02.
Gambar 02: Urutan Sanger
Pengurutan sanger adalah teknik penting yang membantu dalam banyak bidang biologi molekuler. Proyek genom manusia berhasil diselesaikan dengan bantuan metode berbasis sekuensing Sanger. Pengurutan sanger juga berguna dalam pengurutan DNA target, penelitian kanker dan penyakit genetik, analisis ekspresi gen, identifikasi manusia, deteksi patogen, pengurutan mikroba, dll.
Ada beberapa kelemahan dari Sanger sequencing:
- Panjang DNA yang diurutkan tidak boleh lebih dari 1000 pasangan basa
- Hanya satu untai yang dapat diurutkan dalam satu waktu.
- Prosesnya memakan waktu dan mahal.
Oleh karena itu, teknik pengurutan lanjutan yang baru dikembangkan seiring waktu untuk mengatasi masalah ini. Namun, sekuensing Sanger masih digunakan karena hasil yang sangat akurat hingga sekitar 850 fragmen panjang pasangan basa.
Apa itu Pyrosequencing?
Pyrosequencing adalah teknik pengurutan DNA baru berdasarkan "pengurutan dengan sintesis". Teknik ini bergantung pada deteksi pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. Proses ini digunakan oleh empat enzim yang berbeda: DNA polimerse, ATP sulfurylase, luciferase dan apyrase dan dua substrat adenosine 5’ phosphosulfate (APS) dan luciferin.
Proses dimulai dengan pengikatan primer dengan templat DNA untai tunggal dan DNA polimerase memulai penggabungan nukleotida yang melengkapinya. Ketika nukleotida bergabung bersama (polimerisasi asam nukleat), ia melepaskan gugus pirofosfat (dua gugus fosfat yang terikat bersama) dan energi. Setiap penambahan nukleotida melepaskan jumlah pirofosfat yang setara. Pirofosfat diubah menjadi ATP oleh ATP sulfurilase dengan adanya substrat APS. ATP yang dihasilkan mendorong konversi luciferase-mediated dari luciferin menjadi oxyluciferin, menghasilkan cahaya tampak dalam jumlah yang sebanding dengan jumlah ATP. Cahaya dideteksi oleh perangkat pendeteksi foton atau oleh pengganda foto dan menciptakan pirogram. Apyrase mendegradasi ATP dan dNTP yang tidak tergabung dalam campuran reaksi. Penambahan dNTP dilakukan satu per satu. Karena penambahan nukleotida diketahui menurut penggabungan dan deteksi cahaya, urutan cetakan dapat ditentukan. Pyrogram digunakan untuk menghasilkan urutan nukleotida DNA sampel seperti yang ditunjukkan pada Gambar 03.
Pyrosequencing sangat penting dalam analisis polimorfisme nukleotida tunggal dan sekuensing bagian pendek DNA. Akurasi tinggi, fleksibilitas, kemudahan otomatisasi, dan pemrosesan paralel adalah keunggulan pyrosequencing dibandingkan teknik sekuensing Sanger.
Gambar 03: Pyrosequencing
Apa perbedaan antara Sanger Sequencing dan Pyrosequencing?
Pengurutan Sanger vs Pyrosequencing |
|
| Sekuensing Sanger adalah metode sekuensing DNA berdasarkan penggabungan selektif ddNTPs oleh DNA polimerase dan pemutusan rantai. | Pyrosequencing adalah metode sekuensing DNA berdasarkan deteksi pelepasan pirofosfat pada penggabungan nukleotida. |
| Penggunaan ddNTP | |
| ddNTPs digunakan untuk menghentikan replikasi DNA | ddNTP tidak digunakan. |
| Enzim yang terlibat | |
| DNA polimerase digunakan. | Empat enzim digunakan: DNA polimerase, ATP sulfurylase, Luciferase dan Apyrase. |
| Substrat Digunakan | |
| APS dan Luciferin tidak digunakan. | Adenosine 5' phosphosulfate (APS) dan luciferin digunakan. |
| Suhu Maksimum | |
| Ini adalah proses yang lambat. | Prosesnya cepat. |
Ringkasan – Pengurutan Sanger vs Pyrosequencing
Pengurutan Sanger dan Pyrosequencing adalah dua metode pengurutan DNA yang digunakan dalam biologi molekuler. Sekuensing Sanger membangun urutan nukleotida secara berurutan dengan mengakhiri pemanjangan rantai sementara pirosekuens membangun urutan nukleotida yang tepat secara berurutan dengan memasukkan nukleotida dan mendeteksi pelepasan pirofosfat. Oleh karena itu, perbedaan utama antara pengurutan Sanger dan Pyrosequencing adalah bahwa pengurutan Sanger bekerja pada pengurutan dengan pemutusan rantai sementara pyrosequencing bekerja pada pengurutan oleh sintesis.
