Perbedaan Kunci – PCR vs Urutan DNA
PCR dan sekuensing DNA adalah dua teknik penting dalam Biologi Molekuler. Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah proses yang menciptakan sejumlah besar salinan fragmen DNA. Sekuensing DNA adalah teknik yang menghasilkan urutan nukleotida yang tepat dari fragmen DNA yang diberikan. Ini adalah perbedaan utama antara PCR dan sekuensing DNA. PCR adalah salah satu langkah utama yang terlibat dalam sekuensing DNA.
Apa itu PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi DNA yang digunakan dalam Biologi Molekuler. Ini menghasilkan ribuan hingga jutaan salinan fragmen DNA tertentu. Metode ini dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983. Dalam teknik ini, fragmen DNA yang akan diamplifikasi berfungsi sebagai template dan enzim DNA polimerase menambahkan nukleotida komplementer ke primer yang tersedia dalam campuran PCR. Pada akhir reaksi PCR, banyak salinan DNA sampel disintesis.
Ada berbagai komponen campuran PCR, termasuk DNA, DNA polimerase (Taq polimerase), primer (primer maju dan mundur), nukleotida (blok pembangun DNA) dan buffer. PCR terjadi di dalam mesin PCR, dan campuran PCR yang benar harus dimasukkan ke dalam mesin, dan program yang benar harus dijalankan. Teknik ini memungkinkan produksi ribuan hingga jutaan salinan bagian DNA tertentu dari sejumlah kecil DNA.
Reaksi PCR terjadi secara siklik untuk menghasilkan jumlah produk PCR yang terlihat pada gel. Ada tiga langkah utama yang terlibat dalam reaksi PCR yaitu denaturasi, primer annealing dan strand extension seperti yang ditunjukkan pada Gambar 01. Ketiga langkah ini terjadi pada tiga temperatur yang berbeda. DNA ada dalam bentuk untai ganda oleh ikatan hidrogen antara basa komplementer. Sebelum implikasi, DNA untai ganda harus dipisahkan satu sama lain. Hal ini dilakukan dengan memberikan suhu tinggi. Pada suhu tinggi, DNA untai ganda mengalami denaturasi menjadi untai tunggal. Kemudian primer harus lebih dekat ke ujung mengapit dari fragmen spesifik atau gen DNA. Primer adalah bagian pendek dari DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target. Forward dan reverse primer anil dengan basa komplementer di ujung mengapit DNA sampel terdenaturasi pada suhu anil. Primer harus tahan panas. Setelah primer menyatu dengan DNA sampel, enzim taq polimerase memulai sintesis untaian baru dengan menambahkan nukleotida yang melengkapi DNA target. Taq polimerase adalah enzim stabil panas yang diisolasi dari bakteri termofilik yang disebut Thermus aquaticus. Buffer PCR mempertahankan kondisi optimal untuk aksi taq polimerase. Ketiga tahap reaksi PCR ini diulang untuk menghasilkan jumlah produk PCR yang dibutuhkan. Setelah setiap reaksi PCR, jumlah salinan DNA menjadi dua kali lipat. Oleh karena itu, amplifikasi eksponensial dapat diamati dalam PCR. Produk PCR dapat diamati menggunakan elektroforesis gel dan dapat dimurnikan untuk penelitian lebih lanjut.
Gambar 01: Langkah-langkah Utama Reaksi PCR
PCR adalah alat yang berharga dalam penelitian medis dan biologi. PCR memiliki nilai khusus dalam ilmu forensik karena dapat memperkuat DNA untuk studi dari sampel kecil dari para penjahat dan membuat profil DNA forensik. PCR banyak digunakan di banyak bidang biologi molekuler termasuk, genotipe, kloning gen, deteksi mutasi, sekuensing DNA, DNA microarrays dan pengujian paternitas, dll.
Gambar 02: Reaksi Rantai Polimerase
Apa itu Sekuensing DNA?
DNA sequencing adalah penentuan urutan nukleotida yang tepat – adenin, guanin, sitosin, dan timin dalam fragmen DNA tertentu. Informasi genetik disimpan dalam urutan DNA menggunakan urutan nukleotida yang benar. Oleh karena itu, menemukan urutan nukleotida yang tepat dalam fragmen DNA sangat penting untuk mengetahui struktur dan fungsi gen.
Protokol pengurutan DNA melibatkan proses yang berbeda. Langkah pertama adalah isolasi DNA tertarik atau DNA genom dari suatu organisme. Menggunakan PCR (seperti dijelaskan di atas), wilayah DNA yang diinginkan harus diamplifikasi. Produk PCR yang diperkuat harus dipisahkan dengan elektroforesis gel dan dimurnikan. Fragmen yang diperkuat disajikan sebagai templat untuk pengurutan. Sequencing dapat dilakukan baik mengikuti sequencing Sanger atau metode sekuensing throughput tinggi. Sekuensing sanger membutuhkan elektroforesis kapiler dari fragmen DNA yang dihasilkan. Penentuan urutan nukleotida yang benar dapat dilakukan dengan membaca autoradiograf secara manual atau menggunakan sekuenser DNA otomatis.
Pengurutan gen berkontribusi pada proyek genom manusia dan memfasilitasi pemetaan genom manusia pada tahun 2003. Dalam forensik, pengurutan DNA memungkinkan identifikasi individu yang menunjukkan rangkaian DNA unik dan mengidentifikasi penjahat. Dalam kedokteran, pengurutan DNA dapat digunakan untuk mendeteksi gen yang bertanggung jawab atas penyakit genetik dan penyakit lainnya, menemukan gen yang cacat dan menggantinya dengan gen yang benar. Di bidang pertanian, informasi sekuensing DNA dari beberapa mikroorganisme digunakan untuk menghasilkan tanaman transgenik dengan karakteristik ekonomis yang diinginkan.
Gambar 03: Urutan DNA
Apa perbedaan antara PCR dan Sekuensing DNA?
PCR vs Sekuensing DNA |
|
| Proses PCR menciptakan ribuan hingga jutaan salinan fragmen DNA yang tertarik. | Sekuensing DNA adalah proses menentukan urutan nukleotida yang tepat dalam fragmen DNA tertentu. |
| Hasil | |
| PCR membuat ribuan hingga jutaan salinan fragmen DNA tertentu | Ini menghasilkan urutan basa yang benar dalam fragmen DNA tertentu. |
| Keterlibatan ddNTPs | |
| PCR tidak memerlukan ddNTP. Ini menggunakan dNTP. | Pengurutan DNA membutuhkan ddNTP untuk menghentikan pembentukan untai. |
Ringkasan – PCR vs Urutan DNA
PCR dan sekuensing DNA adalah alat yang sangat penting di banyak bidang Biologi Molekuler. Amplifikasi fragmen DNA dilakukan dengan teknik PCR sedangkan urutan nukleotida fragmen DNA yang benar ditentukan oleh sekuensing DNA. Inilah perbedaan antara PCR dan sekuensing DNA.
