Perbedaan utama antara terjemahan nick dan pengisian akhir adalah bahwa terjemahan nick adalah proses yang membuat probe DNA berlabel untuk berbagai reaksi hibridisasi sedangkan pengisian akhir adalah teknik yang menciptakan fragmen tumpul dengan menambahkan nukleotida ke dalam untai tunggal overhang.
Penerjemahan Nick dan pengisian akhir adalah dua teknik yang digunakan dalam biologi molekuler. Terjemahan Nick digunakan untuk pelabelan probe untuk hibridisasi untuk mendeteksi urutan nukleotida tertentu. Pengisian ujung digunakan untuk membuat fragmen tumpul yang memiliki ujung lengket dengan untaian gantung tunggal. Kedua teknik ini sangat penting, dan secara rutin dilakukan di laboratorium penelitian molekuler.
Apa itu Terjemahan Nick?
Terjemahan Nick adalah teknik penting yang digunakan untuk menyiapkan probe berlabel untuk berbagai teknik biologi molekuler seperti blotting, hibridisasi in situ, hibridisasi in situ fluoresen, dll. Ini adalah metode pelabelan DNA in vitro. Probe DNA digunakan untuk mengidentifikasi urutan DNA atau RNA tertentu. Dengan bantuan probe berlabel, fragmen tertentu dapat ditandai atau divisualisasikan dari campuran kompleks asam nukleat. Oleh karena itu probe berlabel disiapkan menggunakan berbagai teknik. Terjemahan Nick adalah salah satu metode yang menghasilkan probe berlabel dengan bantuan enzim DNase 1 dan DNA polimerase 1.
Gambar 01: Terjemahan Nick
Proses penerjemahan Nick dimulai dengan aktivitas enzim DNase 1. DNase 1 memperkenalkan torehan pada tulang punggung fosfat DNA untai ganda dengan memutus ikatan fosfodiester antara nukleotida. Setelah nick dibuat, gugus 3′ OH bebas dari nukleotida akan diproduksi, dan enzim DNA polimerase 1 akan bekerja di atasnya. Aktivitas eksonuklease 5′ hingga 3′ DNA polimerase 1 menghilangkan nukleotida dari nick menuju arah 3′ untai DNA.
Secara bersamaan, aktivitas polimerase enzim DNA polimerase 1 bekerja dan menambahkan nukleotida untuk menggantikan nukleotida yang dihilangkan. Jika nukleotida berlabel, penggantian akan terjadi oleh nukleotida berlabel, dan itu akan menandai DNA untuk identifikasi. Akhirnya, DNA berlabel yang baru disintesis ini dapat digunakan sebagai probe dalam berbagai reaksi hibridisasi.
Apa itu End Filling?
Pengisian ujung adalah teknik yang digunakan dalam biologi molekuler untuk membuat fragmen tumpul. Pencernaan restriksi menghasilkan fragmen dengan overhang. Fragmen ini mungkin tidak kompatibel untuk diligasi menjadi vektor plasmid. Vektor sering tumpul untuk memungkinkan ujung yang tidak kompatibel untuk digabungkan. Oleh karena itu, fragmen dengan overhang dapat ditumpulkan dengan menambahkan nukleotida ke untai komplementer menggunakan overhang sebagai template untuk polimerisasi. Proses ini dikenal sebagai pengisian akhir.
DNA polimerase seperti fragmen Klenow dari DNA Polimerase I dan T4 DNA Polimerase mengkatalisis pengisian akhir. Mereka menambahkan nukleotida untuk mengisi (5′ → 3′) dan mengunyah kembali (3′ → 5′). Setelah ujung lengket terisi, mereka menjadi tumpul, dan siap untuk diligasi menjadi vektor.
Selanjutnya, pengisian ujung dapat digunakan untuk memberi label pada molekul DNA. Namun, itu hanya dapat digunakan untuk memberi label pada molekul DNA dengan ujung yang lengket. Dibandingkan dengan terjemahan nick, pengisian akhir adalah metode yang lebih lembut yang jarang menyebabkan kerusakan DNA.
Apa Persamaan Antara Terjemahan Nick dan Pengisian Akhir?
- Terjemahan nick dan pengisian akhir keduanya adalah teknik biologi molekuler.
- Mereka dapat digunakan untuk memberi label pada probe.
- Keduanya in vitro
Apa Perbedaan Antara Terjemahan Nick dan Pengisian Akhir?
Terjemahan Nick adalah teknik yang membuat probe berlabel untuk hibridisasi. Sebaliknya, pengisian akhir adalah teknik yang menciptakan fragmen tumpul untuk ligasi menjadi vektor. Jadi, inilah perbedaan utama antara terjemahan nick dan pengisian akhir. Selanjutnya, terjemahan Nick memerlukan penggunaan aktivitas eksonuklease 5'ke 3′ sedangkan pengisian akhir tidak memerlukan aktivitas eksonuklease 5'ke 3′.
Infografik di bawah ini menjelaskan perbedaan antara terjemahan nick dan pengisian akhir secara lebih rinci.
Ringkasan – Terjemahan Nick vs Pengisian Akhir
Translasi Nick adalah metode yang menggabungkan nukleotida berlabel radio ke dalam DNA. Ini mensintesis probe berlabel berdasarkan aktivitas enzim DNase 1 dan E. coli DNA polimerase 1. Pengisian akhir, di sisi lain, adalah teknik yang menghasilkan fragmen tumpul. Ketika fragmen memiliki ujung yang lengket (overhang beruntai tunggal), perlu untuk membuat ujungnya tumpul untuk mengikat menjadi vektor. Pengisian ujung menambahkan nukleotida yang kompatibel dan membuat fragmen ujung tumpul agar kompatibel untuk ligasi. Jadi, ini merangkum perbedaan antara terjemahan nick dan pengisian akhir.
