Perbedaan Kunci – SYBR Hijau vs Taqman
SYBR Green dan Taqman adalah dua metode yang digunakan untuk mendeteksi atau melihat proses amplifikasi PCR real-time. SYBR Green adalah metode yang didasarkan pada pewarna pewarnaan asam nukleat interkalasi sedangkan Taqman adalah metode yang didasarkan pada probe hidrolisis. Kedua teknologi dirancang untuk menghasilkan fluoresensi selama PCR, yang memungkinkan mesin PCR real-time untuk memantau reaksi secara "real time". Metode SYBR Green dilakukan dengan menggunakan pewarna fluoresen yang disebut SYBR green dan mendeteksi amplifikasi dengan mengikat pewarna untuk menghasilkan DNA untai ganda. Taqman dilakukan dengan menggunakan probe berlabel ganda dan mendeteksi amplifikasi dengan degradasi probe oleh Taq polimerase dan pelepasan fluorofor. Inilah perbedaan utama antara SYBR Green dan Taqman.
Apa itu SYBR Green?
SYBR Green adalah pewarna fluoresen yang digunakan untuk mewarnai asam nukleat, terutama DNA untai ganda dalam Biologi Molekuler. Metode SYBR Green digunakan untuk mengukur produk PCR selama PCR real-time. Setelah berikatan dengan DNA, kompleks pewarna DNA yang dihasilkan menyerap cahaya biru dan memancarkan cahaya hijau yang intens. Hal ini terjadi karena perubahan struktur yang terjadi pada molekul zat warna saat berikatan dengan DNA untai ganda. Ketika PCR menciptakan lebih banyak DNA, lebih banyak molekul pewarna terikat dengan DNA, menghasilkan lebih banyak fluoresensi. Oleh karena itu, fluoresensi meningkat dengan akumulasi produk PCR. Oleh karena itu, jumlah produk PCR dapat diukur secara kuantitatif dengan deteksi fluoresensi SYBR Green.
Pewarna hijau SYBR juga dapat digunakan untuk pelabelan DNA dalam sitometri dan mikroskop fluoresen. Etidium bromida telah berhasil digantikan oleh SYBR Green karena Etidium bromida adalah pewarna karsinogenik dengan masalah pembuangan selama visualisasi DNA dalam elektroforesis gel.
Ada kelebihan dan kekurangan metode SYBR green. Metode ini sangat sensitif, murah dan mudah digunakan. Namun, karena kemampuannya untuk mengikat DNA untai ganda, pengikatan nonspesifik dapat menyebabkan kuantifikasi produk PCR yang berlebihan.
Gambar 01: Teknik Hijau SYBR
Apa itu Taqman?
Taqman adalah metode alternatif SYBR Green untuk memantau proses PCR secara real-time. Metode ini bergantung pada aktivitas eksonuklease 5’ – 3’ enzim Taq polimerase untuk mendegradasi probe selama perpanjangan untai baru dan pelepasan fluorofor. Probe berlabel ganda digunakan dalam metode ini dan didasarkan pada hidrolisis probe. Probe diberi label oligonukleotida DNA berfluoresensi yang memiliki molekul reporter fluoresen (fluorofor) di ujung 5' dan molekul quencher di ujung 3'. Mereka dirancang untuk mengikat template untai tunggal di sisi berlawanan dari anil primer. Taq polimerase menambahkan nukleotida ke primer dan memperpanjang untai baru menuju probe berlabel ganda. Setelah Taq polimerase memenuhi probe, aksi eksonuklease dari Taq polimerase mengaktifkan dan menurunkan probe. Setelah menyelesaikan sintesis untai baru, probe mengalami degradasi lengkap dan melepaskan fluorofor. Pelepasan fluorofor menghasilkan fluoresensi. Molekul Fluorescent Quencher secara efisien memadamkan cahaya yang dipancarkan dan menciptakan output untuk kuantifikasi produk PCR. Pelepasan fluorofor dan kuantitas produk PCR sebanding. Oleh karena itu, kuantifikasi dapat dengan mudah dilakukan dengan metode Taqman.
Gambar 02: Metode Taqman
Metode Taqman digunakan secara real time PCR, kuantifikasi ekspresi gen, deteksi polimorfisme genetik, kuantifikasi penghapusan DNA kromosom, identifikasi bakteri, verifikasi analisis microarray, genotipe SNP dll.
Apa perbedaan antara SYBR hijau dan Taqman?
SYBR Hijau vs Taqman |
|
| SYBR Green didasarkan pada pewarna pengikat DNA. | Taqman bergantung pada probe hibridisasi dan aktivitas eksonuklease Taq polimerase 5' hingga 3'. |
| Probe Berlabel Fluorescent | |
| Tidak diperlukan probe berlabel fluoresen. | Probe berlabel ganda diperlukan. |
| Analisis Gen Multipleks | |
| Tidak dapat digunakan untuk target gen multipleks. | Dapat digunakan untuk target gen multipleks. |
| Biaya | |
| Ini lebih murah. | Ini lebih mahal. |
| Kekhususan | |
| Ini kurang spesifik dan mengikat dengan DNA untai ganda | Ini sangat spesifik karena probe mendeteksi produk amplifikasi spesifik. |
| Efektifitas | |
| Ini kurang efektif. | Ini sangat efektif. |
| Aplikasi | |
| Ini digunakan dalam PCR waktu nyata, visualisasi gel agarosa, pelabelan DNA, dll. | Ini digunakan dalam PCR waktu nyata, kuantifikasi ekspresi gen, deteksi polimorfisme genetik, dll. |
Ringkasan – SYBR Green dan Taqman
Taqman dan SYBR green adalah dua metode yang digunakan dalam PCR (PCR kuantitatif) waktu nyata. Kedua metode memungkinkan kuantifikasi produk PCR secara efisien dan bergantung pada emisi fluoresensi. Metode Taqman menggunakan probe berlabel ganda untuk mendeteksi akumulasi DNA sedangkan metode SYBR Green menggunakan pewarna fluoresen. Kedua metode ini juga memiliki aplikasi yang berbeda dalam biologi molekuler.
