Perbedaan utama antara uji PCR bersarang konvensional dan real-time adalah bahwa PCR konvensional adalah teknik yang dikembangkan untuk mengamplifikasi sekuens DNA tertentu dan PCR bersarang adalah modifikasi dari PCR konvensional yang terdiri dari dua reaksi amplifikasi sekuensial, sedangkan PCR nyata -time PCR merupakan varian dari PCR konvensional yang mampu mengkuantifikasi produk hasil amplifikasi.
PCR adalah teknik ilmiah yang sangat umum digunakan secara luas dalam penelitian dan kedokteran untuk mendeteksi DNA. Tes PCR digunakan untuk mendeteksi antigen dengan mendeteksi DNA atau RNA mereka. Umumnya, RNA virus ada di dalam tubuh sebelum mendeteksi antibodi atau menunjukkan gejala penyakit. Tes PCR dapat mengetahui apakah seseorang memiliki virus sejak dini. Saat ini, PCR merupakan tes standar untuk mendeteksi penyakit COVID-19. Ada berbagai jenis teknik PCR seperti real-time PCR, nested PCR, multiplex PCR, hot start PCR dan long-range PCR, dll.
Apa itu Pemeriksaan PCR Konvensional?
Tes PCR konvensional adalah teknik amplifikasi DNA in vitro yang rutin dilakukan di laboratorium biologi molekuler. Metode ini memungkinkan produksi ribuan hingga jutaan salinan fragmen DNA tertentu. Kary Mullis memperkenalkan teknik ini pada tahun 1980. Teknik ini membutuhkan sebuah fragmen DNA yang dikenal sebagai template untuk membuat banyak salinannya. Taq polimerase bekerja sebagai enzim DNA polimerase dan mengkatalisis sintesis untaian baru dari urutan template.
Primer dalam campuran PCR akan berfungsi sebagai titik awal untuk ekstensi fragmen. Semua bahan yang diperlukan untuk membuat salinan DNA termasuk dalam campuran PCR. Reaksi PCR dijalankan dalam mesin PCR, dan harus diisi dengan campuran PCR yang benar dan program PCR yang benar. Jika campuran reaksi dan programnya benar, itu akan menghasilkan jumlah salinan yang diperlukan dari bagian DNA tertentu dari sejumlah kecil DNA.
Gambar 01: Uji PCR Konvensional
Ada tiga langkah utama yang terlibat dalam reaksi PCR: denaturasi, anil primer, dan ekstensi untai. Ketiga langkah ini terjadi pada tiga temperatur yang berbeda. Buffer PCR mempertahankan kondisi optimal untuk aksi Taq polimerase. Ketiga tahap reaksi PCR ini diulang untuk menghasilkan jumlah produk PCR yang dibutuhkan. Pada setiap reaksi PCR, jumlah salinan DNA berlipat ganda. Oleh karena itu, amplifikasi eksponensial dapat diamati dalam PCR. Produk PCR dapat diselesaikan menggunakan elektroforesis gel karena menghasilkan jumlah DNA yang terlihat pada gel, dan dapat dimurnikan untuk penelitian lebih lanjut seperti sekuensing.
PCR adalah alat yang berharga dalam penelitian medis dan biologi. Khususnya dalam studi forensik, PCR memiliki nilai yang sangat besar karena dapat mengamplifikasi DNA untuk studi dari sampel kecil para penjahat dan membuat profil DNA forensik. PCR banyak digunakan di banyak bidang biologi molekuler termasuk, genotipe, kloning gen, deteksi mutasi, sekuensing DNA, DNA microarrays, dan pengujian paternitas.
Apa itu Tes PCR Bersarang?
Nested PCR adalah jenis PCR yang mengurangi amplifikasi DNA yang tidak spesifik. Ada dua PCR berturut-turut atau dua reaksi amplifikasi berurutan dalam uji PCR bersarang. Selama reaksi amplifikasi pertama, produk PCR diproduksi. Setelah reaksi pertama, reaksi amplifikasi kedua dilakukan pada produk PCR dari reaksi pertama. Oleh karena itu, primer pada campuran reaksi kedua berikatan dengan produk PCR pertama dan mengamplifikasinya.
Gambar 02: Nested PCR
Pasangan primer berbeda dalam setiap reaksi. Pengikatan primer non-spesifik berkurang dalam PCR bersarang. Tes PCR bersarang berguna untuk meningkatkan sensitivitas dan/atau spesifisitas. Namun, PCR bersarang membutuhkan pengetahuan tentang urutan yang diinginkan.
Apa itu Tes PCR Waktu Nyata?
Real-time PCR atau PCR kuantitatif (Q PCR) adalah versi modifikasi dari PCR yang mengukur produk PCR secara kuantitatif. Oleh karena itu, teknik ini mengukur amplifikasi secara real-time menggunakan mesin PCR real-time. Ini juga merupakan metode yang cocok untuk menentukan jumlah urutan target atau gen yang ada dalam sampel.
Fitur menarik dari PCR waktu-nyata adalah menggabungkan amplifikasi dan kuantifikasi sebenarnya ke dalam satu langkah. Oleh karena itu, kebutuhan akan elektroforesis gel untuk pendeteksian dapat dihilangkan dengan teknik real-time PCR. Penggunaan pewarna fluoresen untuk memberi label produk PCR selama reaksi PCR pada akhirnya akan mengarah pada kuantifikasi langsung. Ketika produk PCR terakumulasi, sinyal fluoresen juga terakumulasi, dan mereka akan diukur oleh mesin waktu nyata. SYBR Green dan Taqman adalah dua metode untuk mendeteksi atau melihat proses amplifikasi PCR real-time. Kedua metode memantau kemajuan proses amplifikasi dan melaporkan kuantitas produk secara real-time.
Gambar 03: PCR Waktu Nyata
Real-time PCR memiliki berbagai aplikasi seperti kuantifikasi ekspresi gen, analisis RNA mikro dan non-coding, genotipe SNP, deteksi varian nomor salinan, deteksi mutasi langka, deteksi organisme yang dimodifikasi secara genetik, dan deteksi agen infeksi.
Apa Persamaan Antara Tes PCR Bersarang Konvensional dan Real-time?
- Tes PCR bersarang dan real-time adalah modifikasi dari uji PCR konvensional.
- Ketiga teknik tersebut memperkuat sampel DNA.
- Produk mereka dapat digunakan dalam pengurutan atau analisis.
- Tes ini membutuhkan primer.
Apa Perbedaan Antara Tes PCR Bersarang Konvensional dan Real-time?
PCR konvensional adalah teknik yang dikembangkan untuk mengamplifikasi sekuens DNA tertentu. Sedangkan Nested PCR merupakan modifikasi dari PCR konvensional yang terdiri dari dua reaksi amplifikasi sekuensial, dan real-time PCR merupakan varian dari PCR konvensional yang mampu mengkuantifikasi produk hasil amplifikasi. Jadi, inilah perbedaan utama antara pengujian PCR konvensional dan real-time. Tidak seperti PCR konvensional dan real-time, PCR bersarang menggunakan dua set primer. Selain itu, ada dua reaksi amplifikasi berturut-turut dalam PCR bersarang untuk mengurangi amplifikasi non-spesifik. selain itu, uji PCR konvensional dan real-time tidak mengandung dua reaksi amplifikasi berurutan.
Infografik berikut mencantumkan perbedaan antara uji PCR konvensional dan real-time dalam bentuk tabel untuk perbandingan berdampingan.
Ringkasan – Uji PCR Konvensional vs Bersarang vs Real-time
PCR konvensional adalah teknik pertama yang dikembangkan untuk mengamplifikasi fragmen DNA tertentu. Nested PCR dan real-time PCR adalah dua varian dari PCR konvensional. Ada dua reaksi amplifikasi sekuensial dan penggunaan dua set primer dalam nested PCR. PCR real-time dikembangkan untuk mengukur produk PCR yang diperkuat. Dengan demikian, ini merangkum perbedaan antara pengujian PCR konvensional dan real-time.
