Perbedaan Kunci – RT PCR vs QPCR
Reaksi Berantai Polimerase adalah teknik yang digunakan untuk mengamplifikasi wilayah DNA tertentu secara in vitro. Karena penemuan teknik ini oleh Kary Mullis pada tahun 1983, para ilmuwan mampu membuat ribuan hingga jutaan salinan fragmen DNA tertentu untuk tujuan penelitian. Saat ini telah menjadi teknik umum dan rutin dilakukan di laboratorium klinis dan penelitian untuk berbagai aplikasi. Ada variasi teknik PCR tradisional seperti RT PCR, PCR bersarang, PCR multipleks, PCR Q, RT – QPCR, dll. RT PCR dan Q PCR adalah dua variasi penting dari PCR. Perbedaan utama antara RT PCR dan Q PCR adalah bahwa RT PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen melalui pembuatan transkrip DNA komplementer (cDNA) dari RNA sementara Q PCR digunakan untuk mengukur produk PCR secara kuantitatif secara real time menggunakan pewarna fluoresen.
Apa itu RT PCR?
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) adalah varian dari PCR yang digunakan untuk mendeteksi ekspresi RNA. Ini adalah metode yang sangat penting untuk mendeteksi ekspresi mRNA dalam jaringan. RT PCR digunakan ketika bahan awal sampel adalah RNA. Dalam RT PCR, template mRNA pertama-tama diubah menjadi DNA komplementer. Langkah ini dikatalisis oleh enzim reverse transcriptase dan prosesnya dikenal sebagai reverse transcription. Kedua, PCR tradisional digunakan untuk cDNA yang baru disintesis untuk amplifikasi.
RT PCR adalah teknik yang sangat sensitif yang membutuhkan sampel RNA dalam jumlah yang relatif kecil. RT PCR umumnya digunakan dalam diagnosis dan kuantifikasi spesies RNA, terutama virus RNA seperti human immunodeficiency virus dan virus hepatitis C.
Gambar 01: Teknik RT PCR
Apa itu QPCR?
Quantitative PCR (QPCR) adalah varian dari PCR yang digunakan untuk mengukur produk PCR secara kuantitatif. Ini juga disebut sebagai reaksi berantai polimerase waktu nyata karena mengukur amplifikasi waktu nyata menggunakan mesin PCR waktu nyata. Ini adalah metode yang cocok untuk menentukan jumlah urutan target atau gen yang ada dalam sampel. Fitur menarik dari QPCR adalah menggabungkan amplifikasi dan kuantifikasi sebenarnya menjadi satu langkah. Oleh karena itu, kebutuhan akan elektroforesis gel dalam pendeteksian dapat dihilangkan dengan teknik QPCR. QPCR menggunakan pewarna fluoresen untuk memberi label produk PCR selama reaksi PCR yang akhirnya mengarah pada kuantifikasi langsung. Ketika produk PCR terakumulasi, sinyal fluoresen juga terakumulasi dan akan diukur oleh mesin waktu nyata. QPCR dapat dikombinasikan dengan RT PCR. Ini dikenal sebagai RT - QPCR atau QRT - PCR dan dianggap sebagai metode yang paling kuat, sensitif dan kuantitatif untuk mendeteksi tingkat RNA dalam sel atau jaringan.
SYBR Green dan Taqman adalah dua metode yang digunakan untuk mendeteksi atau melihat proses amplifikasi PCR secara real time. Metode SYBR Green dilakukan dengan menggunakan pewarna fluoresen yang disebut SYBR green dan mendeteksi amplifikasi dengan mengikat pewarna untuk menghasilkan DNA untai ganda. Taqman dilakukan menggunakan probe berlabel ganda dan mendeteksi amplifikasi dengan degradasi probe oleh Taq polimerase dan pelepasan fluorofor seperti yang ditunjukkan pada gambar 02. Kedua metode memantau kemajuan proses amplifikasi dan melaporkan kuantitas produk secara real time.
Real time PCR memiliki beragam aplikasi seperti kuantifikasi ekspresi gen, analisis RNA mikro dan nonkode, genotipe SNP, deteksi varian nomor salinan, deteksi mutasi langka, deteksi organisme hasil rekayasa genetika, deteksi agen infeksi, dll.
Gambar 02: Teknik PCR Kuantitatif
Apa perbedaan antara RT PCR dan QPCR?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT PCR adalah teknik yang digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen dengan amplifikasi. | QPCR adalah teknik yang mengamplifikasi DNA dan mengkuantifikasi produk PCR secara real time. |
| Keterlibatan Enzim Transkriptase Terbalik | |
| Enzyme reverse transcriptase digunakan untuk RT PCR. | Enzyme reverse transcriptase tidak digunakan untuk QPCR. |
| Penggunaan Molekul Berlabel Fluoresen | |
| Pewarna atau probe berlabel fluoresen tidak digunakan untuk RT PCR. | Pewarna atau probe berlabel fluoresen digunakan untuk QPCR. |
| Kuantifikasi produk PCR | |
| Kecuali digabungkan dengan QPCR, RT PCR tidak mengukur produk PCR. | QPCR mengukur produk PCR secara kuantitatif. |
| Bahan Awal | |
| Materi awal adalah mRNA. | Bahan awal adalah DNA. |
| Sintesis cDNA | |
| DNA komplementer diproduksi selama RT PCR. | DNA komplementer tidak diproduksi selama QPCR. |
Ringkasan – RT PCR vs QPCR
RT PCR dan QPCR adalah dua versi PCR tradisional. Teknik RT PCR dilakukan untuk sampel mRNA dan didorong oleh transkripsi balik dan produksi cDNA. QPCR digunakan untuk mengukur produk PCR selama siklus termal PCR waktu nyata menggunakan pewarna fluoresen atau probe berlabel. Dalam QPCR, jumlah produk PCR diwakili oleh sinyal fluoresen yang dipancarkan oleh sampel. RT PCR populer digunakan sebagai proses amplifikasi sedangkan QPCR umumnya digunakan sebagai proses kuantifikasi. Inilah perbedaan antara RT PCR dan QPCR.
